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荧光的应用之全内反射荧光显微镜

发布时间:2020-03-27 点击次数:1494
  TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscope),全内反射荧光显微镜,利用光从高折射率的介质进入较低折射率的介质时,如果入射角足够大时则光全部被反射而不发生折射,但是在两种介质的界面会产生衰逝波可以激发近界面100nm范围内的荧光的原理来实现对物体表面的观察。可通过常规荧光显微镜的照明器或特殊照明器送入激发光,并对激光的入射角度进行控制,采用瞬间场激发方法以避免激发光进入探测器,在玻璃和水界面的激发光产生全内反射实现的。因为激发光呈指数衰减的特性,只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射,大大降低了背景光噪声干扰观测标的,故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。
 
全内反射荧光显微镜 (TIRFM)示意图
全内反射荧光显微镜 (TIRFM)示意图
 
  ①样品 ②损耗波范围 ③盖玻片 ④浸镜油 ⑤目标 ⑥发射光束(信号) ⑦激发光束
 
  为了实现全内反射,需要大的入射角,例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。这可以通过棱镜(prism)实现,称为棱镜型TIRFM(prism-based TIRFM),也可通过高数值孔径的物镜实现,此时称为物镜型TIRFM(objective-type TIRFM)。现在商品化的全内反射荧光显微镜一般都是物镜类型的,速度快,精度高。
 
  全内反射荧光显微镜由于能实现物体表面非常薄范围内(小于100nm)荧光观察,故在某些生物领域得到广泛应用。如以下等应用:
 
  细胞表面图象的观察:细胞膜表面结构、细胞表层的接触、膜表面动力学/蛋白质定位。
 
  单分子观察及其操作:肌球蛋白、肌动蛋白与Cy3标记ATP。
 
  细胞膜表面运动:如泡吞、泡吐现象,泡外分泌现象。
 
  细胞膜钙火花现象的观察,离子通道监视。
 
  分子马达研究:旋转的马达、细胞骨架蛋白、聚合体、G蛋白、环状蛋白、核苷酸马达。
 
  除了在生物领域外,在化学领域等对于化学分子结构观察中也有很好的应用。

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